由于能夠提供分辨率越來越高的結(jié)構(gòu)信息，冷凍電鏡迎來了科學(xué)發(fā)現(xiàn)的新時代。硬件和軟件的進步使這項技術(shù)在基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)中得到了更廣泛的應(yīng)用。冷凍電鏡用于對一系列生物樣本進行可視化成像，從大型細胞器（使用冷凍層析成像）一直到接近原子分辨率水平的單顆粒分析。

目前。主要有三種使用冷凍電鏡的方法，具體包括：

單顆粒分析

單顆粒分析（SPA）是一種成熟的冷凍電鏡技術(shù)，允許結(jié)構(gòu)生物學(xué)家在近原子分辨率下研究大分子的詳細結(jié)構(gòu)，以揭示豐富的生物學(xué)見解。

冷凍斷層掃描

冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）使用分子水平的3D成像來產(chǎn)生關(guān)于單個蛋白質(zhì)及其所處細胞環(huán)境的高分辨率結(jié)構(gòu)和空間信息。

微電子衍射

微電子衍射(MicroED)是一種新興的從納米晶體中確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，將冷凍電鏡樣品制備方法與X射線晶體衍射數(shù)據(jù)分析方法結(jié)合起來。

冷凍電鏡的最新技術(shù)進步在獲得更高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)方面取得了重大進展，成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)家的首選方法。將樣品保存在玻璃態(tài)冰中（玻璃化）通常被認為是冷凍電鏡（Cryo-EM）工作流程的第一步。但是，在制備樣品之前，研究人員必須考慮樣品質(zhì)量，并確定其是否適合高分辨率結(jié)構(gòu)測定。

在開始使用任何冷凍電鏡之前，對這些關(guān)鍵因素和儀器正確的深入理解至關(guān)重要，以確保后續(xù)項目的成功。

＜閱讀我們的博客文章，了解單顆粒冷凍電鏡樣品制備的入門知識＞

當(dāng)然，高質(zhì)量的樣品制備是常規(guī)冷凍電鏡工作流程中公認的、尚未解決的瓶頸。標準的冷凍電鏡工作流程一個復(fù)雜和重復(fù)過程，包括不同規(guī)格種類的載網(wǎng)冷凍以及之后使用冷凍電鏡篩選高質(zhì)量的樣本。這個過程需要在低溫條件下手工操作小而脆弱的載網(wǎng)。但最終樣本載網(wǎng)的質(zhì)量通常由于人為操作從而導(dǎo)致一致性存在差異。此外，不同研究人員在冷凍電鏡方面的不同經(jīng)驗導(dǎo)致對樣品質(zhì)量“好壞”的判斷存在不一致，這同樣是產(chǎn)生差異的原因。

高分辨率冷凍電鏡測定單顆粒結(jié)構(gòu)的主要障礙之一就是氣液界面效應(yīng)（AWI）。最佳的做法是在處理蛋白樣品溶液時避免由于AWI導(dǎo)致蛋白降解可能產(chǎn)生的氣泡。

在樣品玻璃態(tài)化形成薄層的過程中，氣液界面效應(yīng)（AWI）可能會導(dǎo)致顆粒分子發(fā)生降解和聚集以及取向優(yōu)勢等負面影響。

不斷涌現(xiàn)的新樣品制備方法使得在單一平臺上推動流程的優(yōu)化以獲得可重復(fù)的高分辨率結(jié)果成為可能。在給定的樣品濃度、緩沖液和冰厚度的條擬下，如果在快速冷凍的時間范圍內(nèi)能確定樣品的表現(xiàn)，則在后續(xù)的步驟中就可以集中解決其他不利影響。Chameleon的方法是解決樣品制備瓶頸問題的一種突破，利用更少的樣品獲得更好的結(jié)果，最終有利于減少整體的實驗成本。