3D 細胞培養(yǎng)可以在以下方面彌補體外和體內(nèi)實驗研究之間的差距：

• 提高臨床前實驗分析的效率和數(shù)據(jù)質(zhì)量
• 提高解讀癌癥等疾病的可能性
• 與2D細胞培養(yǎng)相比，為開發(fā)和個性化醫(yī)療提供更多藥物反應數(shù)據(jù)
• 減少對動物實驗的依賴

3D細胞培養(yǎng)技術發(fā)展迅猛，開發(fā)者眾多，這導致術語使用不一致。闡明術語有助于解決該問題。(²) 由于貼壁細胞趨向于聚集的特性而形成的球體類細胞被作為簡單的 3D 模型廣泛使用，并且可以由許多不同類型的細胞生成。類器官是更復雜的 3D 聚合體，類似于微型化和簡化版的器官。它們可能來源于組織或由干細胞衍生，在空間上能夠有序排列并具備器官的特異性功能。(³)

支持3D 細胞培養(yǎng)的模式如下(⁴) 包括：

• 非錨定依賴性（不以支架為基礎）：懸滴、低吸附板、微圖案板
• 錨定依賴性：生物水凝膠（例如 Matrigel(R)，膠原蛋白）或合成水凝膠
• 類器官芯片

值得注意的是，目前尚無任何金標準技術。最優(yōu)的3D 細胞培養(yǎng)方式取決于眾多因素，包括：

• 細胞系和細胞來源（永生細胞、原代細胞、誘導多能干細胞、組織外植體）
• 預期的待建模生物學復雜性/相關性水平
• 通量要求
• 成本
• 實驗的可重復性

錨定依賴性模型具有極高的可擴展性、經(jīng)濟性和可重復性，是頗受歡迎的簡單球體細胞培養(yǎng)模型。然而，該模型缺乏與細胞外基質(zhì)之間的相互作用，這限制了其在某些方面的應用。

錨定依賴性培養(yǎng)無需專用培養(yǎng)板，可同時適用于支持簡單和復雜的 3D 細胞培養(yǎng)模型。例如 ，Matrigel ? 或膠原蛋白之類的動物來源性的支架，能夠為體內(nèi)實驗的細胞提供機械和物理固定。

然而，一些批評指出，動物來源性水凝膠的成分存在不同批次間的差異，并且源自癌細胞培養(yǎng)物的水凝膠并不能體現(xiàn)生物因子的健康生理水平。另一方面，合成支架雖然不受批次間差異的影響，但缺乏支持正常細胞粘附、生長和分化所需的部分屬性。 (²)

類器官芯片形式可支持復雜且高度專業(yè)化的 3D 細胞培養(yǎng)物的生長，這些細胞培養(yǎng)物模擬了器官的功能和復雜性。它們由可供（嵌入）細胞生長的微流體通道和液體灌注通道組成。

目前已出現(xiàn)商業(yè)化的類器官芯片技術，但大部分仍處于內(nèi)部研發(fā)階段。現(xiàn)階段，芯片的高成本使得該技術無法廣泛應用于高通量篩選，但正被越來越多地應用于研發(fā)和小規(guī)模篩選。

目前3D細胞培養(yǎng)的適用領域包括：

• 基礎研究
• 藥物開發(fā)
• 個性化醫(yī)療

隨著研究人員從 2D 細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向 3D 細胞培養(yǎng)，在細胞系的選擇上也出現(xiàn)了類似的趨勢。如今，原代細胞、誘導多能干細胞和共培養(yǎng)細胞比永生細胞系更受青睞。

基因組學在 3D 細胞培養(yǎng)應用中發(fā)揮著越來越重要的作用。CRISPR-Cas9 等基因組編輯技術為科學家在研究突變對疾病進程的影響時提供了工具。此外，二代測序技術（NGS）也有助于人們深入了解癌癥等疑難病癥的復雜構成（通常具有異質(zhì)性）。

3D細胞培養(yǎng)應用于基礎研究和疾病模型建立

3D細胞培養(yǎng)被廣泛用于基礎研究和癌癥等疾病模型建立。(⁵)

通過20多年的研究，我們已經(jīng)取得了充分的證據(jù)，這些證據(jù)揭示了腫瘤微環(huán)境（TME）在癌癥發(fā)展和進程中的關鍵作用。在二維 (2D) 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞在平整的固體表面上以單層形式生長，缺乏原發(fā)腫瘤的特性，即細胞-細胞和細胞-基質(zhì)的相互作用。這些 2D 培養(yǎng)的細胞被拉伸并經(jīng)歷細胞骨架重排，獲得人工極性，進而導致基因和蛋白表達的異常。相比之下，3D 培養(yǎng)系統(tǒng)可以在空間上單獨培養(yǎng)腫瘤細胞或?qū)⒏黝惣毎祀s在一起培養(yǎng)腫瘤胞，這更有利于細胞 – 細胞和細胞 – 基質(zhì)相互作用，從而更好地模擬腫瘤的天然環(huán)境。這些相互作用導致 3D 培養(yǎng)細胞具備反映體內(nèi)腫瘤形態(tài)和細胞特征的能力。

基于這些優(yōu)勢，研究人員使用腫瘤球體來研究癌癥生物學中涉及的各種機制，包括：

• 代謝和缺氧誘導的變化
• 腫瘤細胞浸潤和遷移
• 腫瘤干細胞
• 腫瘤微環(huán)境信號偶聯(lián)

除腫瘤領域外，3D細胞培養(yǎng)還被用于基礎研究的其他領域，包括：

• 神經(jīng)退行性疾病的研究(⁶)
• 體外血腦屏障(⁷)模型的開發(fā)
• 胰腺類器官，可能作為胰腺癌和糖尿病的模型(⁸)
• 腸類器官，作為囊腫性纖維化模型(⁹)

3D細胞培養(yǎng)用于藥物開發(fā)

大多數(shù)潛在的候選藥物都無法通過臨床試驗（80%），這一數(shù)字在腫瘤藥物的比例甚至更高。 (¹⁰) 失敗的最常見原因是缺乏療效，但仍有高達17% 的 3 期臨床試驗由于安全問題而失敗。 (¹¹)

3D 細胞培養(yǎng)已成為臨床前藥物研發(fā)各個階段（從疾病建模、靶點識別和驗證到篩選、先導藥物的選擇、藥物有效性和安全性評估）十分有價值的工具。研究人員經(jīng)常在模型預測的價值和成本、設置的難易程度和通量之間進行權衡。由于自動化3D細胞培養(yǎng)模型的成本、復雜性和難度較大，通常只在適度通量下展開藥物篩選，一般不超過100,000種化合物。事實上，大規(guī)模藥篩尚未在 3D 細胞中進行，但可以使用 3D 模型驗證藥敏藥效和藥物毒性。 如果使用的化合物數(shù)量較少，使用更先進的模型或類器官芯片技術便成為可能。

在藥物開發(fā)過程中，化合物在進入臨床階段之前必須經(jīng)過嚴格的安全性測試。臨床前安全性評估包括體外試驗（生化和傳統(tǒng)的 2D 細胞培養(yǎng)分析）和后續(xù)的動物試驗。

3D 細胞培養(yǎng)尚未達到可以取代動物毒性測試的階段，但考慮到高成本、倫理問題以及動物與人類之間的生理差異，3D細胞培養(yǎng)可發(fā)展為極具前景的另一選擇。用于檢測肝毒性(¹²)和心臟毒性(¹³)的新型3D細胞培養(yǎng)模式的開發(fā)推動了這一進程。 然而，尚無充分的證據(jù)顯示這些方法可以改善動物試驗的生理相關性。另一方面，在解釋免疫和心血管系統(tǒng)上是否仍然缺乏復雜性值得探究(¹³)。

盡管在將3D細胞培養(yǎng)應用于藥物開發(fā)，尤其在用于高通量篩選時面臨諸多挑戰(zhàn)，但通過與更優(yōu)化的細胞模型（例如干細胞和原代細胞）聯(lián)合使用，3D細胞培養(yǎng)能夠更好地預測藥物在進入臨床試驗之前的體內(nèi)藥效和毒性，而這反過來可降低正在開發(fā)中的新型分子藥物的損耗率。

3D細胞培養(yǎng)用于個性化醫(yī)療

分子靶向治療能夠持續(xù)改善許多癌癥患者的狀況。眾所周知，患者之間存在顯著的腫瘤異質(zhì)性，甚至同一種腫瘤的患者之間也存在顯著的異質(zhì)性。這些異質(zhì)性限制了靶向治療對特定亞型患者的療效，并最終導致復發(fā)。 (¹⁴)

腫瘤的基因檢測在臨床中已經(jīng)司空見慣，主要用于識別癌癥亞型并指導靶向治療。 然而，許多癌癥會發(fā)生大量基因型和表型的變化，而我們?nèi)狈蛐?表型關系的深入理解。因此，需要補充方案來指導治療。 (¹⁴)

患者來源的類器官雖保留了原始腫瘤的異質(zhì)性，但允許在體外檢測不同藥物或藥物組合的療效。 “患者來源性類器官模型藥物篩選”尚未得到充分驗證可作為臨床預測性生物標志物。因此，需要更多的研究和開發(fā)來標準化患者衍生的類器官并完善模型。可建立癌癥生物樣本庫，提供獲取相關細胞的途徑，這將有助于實現(xiàn)該目標。在未來，我們可能會看到將源自患者的類器官和基因檢測作為指導個性化醫(yī)療的補充工具。 這一富有前景的發(fā)展將有望提高藥物治療效果，并最大限度地減少毒副作用。(¹⁵)

3D 細胞培養(yǎng)技術已經(jīng)進入制藥和學術領域，并被越來越多地應用于個性化醫(yī)療。隨著3D細胞培養(yǎng)板、芯片和專門的細胞系的市場化，以及生物樣本庫資源的開放，越來越多的受眾可獲取到相關技術。在制藥領域，腫瘤學仍然是3D細胞培養(yǎng)技術和方法最常見的應用方向。此外，在學術界，它們也被廣泛地應用于各種研究領域。

3D細胞培養(yǎng)應用難點主要存在于以下兩個方面(³)：

• 3D 細胞培養(yǎng)模型的科學驗證及其預測藥敏藥效能力的量化
• 以下方面相關的過程和技術挑戰(zhàn)：實驗方法的標準化、通量的增加、分析管線的開發(fā)，以及如何持續(xù)降低成本。

3D細胞培養(yǎng)模型的驗證

大量研究表明，2D 和 3D 細胞培養(yǎng)會產(chǎn)生不同的藥物反應，目前尚不清楚3D細胞培養(yǎng)反映疾病生物學的具體精準度。2D和3D細胞培養(yǎng)模型對疾病的預測價值將有助于確定藥物成功干預后的表型變化指針。在獲得此類數(shù)據(jù)之前，3D細胞培養(yǎng)將繼續(xù)與2D細胞培養(yǎng)和生化分析相輔相成。表型模型的金標準必將出現(xiàn)，但目前尚未就此達成科學共識。其次是監(jiān)管問題。隨著表型篩選方法的復興，目標反卷積對于獲得監(jiān)管批準至關重要。目前，3D培養(yǎng)細胞的毒理學實驗尚不能完全取代動物試驗。無論如何，它們作為一種支持性方法具有潛在的應用價值，能夠在藥物研發(fā)周期中更早的淘汰毒理學結果較差的化合物，從而最大程度地減少實驗動物的使用。

過程中的挑戰(zhàn)

成本
由于需要專門的細胞、試劑（基底膜提取液）和耗材（專用板或芯片），3D細胞培養(yǎng)應用的成本顯著高于2D細胞培養(yǎng)應用。

標準化和可重復性
起始物料的高度生物學差異性和標準方法的缺乏導致實驗的可重復性較低。

由于敏感細胞和對溫度敏感的試劑并不直接適合自動化，高通量將難以實現(xiàn)。雖然在不依賴錨定的培養(yǎng)模型中進行簡單的球狀體檢測相對容易實現(xiàn)自動化，但對于類器官而言難度要大得多，因為它們依賴于溫度敏感性材料，如Matrigel ? 或器官芯片結構。 類器官培養(yǎng)需要具有嚴格的定位精度和溫度控制以實現(xiàn)精準的液體處理。 在大多數(shù)情況下，高通量培養(yǎng)模型仍僅限于 96或384 微孔板。

材料的缺乏普遍存在，因為可獲取的原代或患者來源的細胞通常數(shù)量有限。 為獲得用于一次篩選的足量細胞，往往需要幾周甚至數(shù)月。

分析流程也存在問題。雖然一些簡單的全孔實驗分析讀數(shù)（例如ATP定量實驗）并不難，但只有在多參數(shù)表型分析后才能獲得最全面的結論，并利用復雜的細胞反應模式對化合物藥效進行分類。這需要高內(nèi)涵成像和分析流程、小生境技術和足夠的執(zhí)行時間，因此限制了與某些 3D 細胞培養(yǎng)模型的兼容性。 (²)

實現(xiàn)類器官處理的自動化一直以來都具有挑戰(zhàn)性，原因包括支持這些模型的細胞供應有限、傳統(tǒng)移液工作站和分液器的死體積過大且難以處理粘稠的基底膜提取物。此外，高度可重復的 3D 細胞培養(yǎng)也較為困難。(16) 鑒于許多 3D 細胞培養(yǎng)應用的通量不大，手動移液仍然是許多實驗室的常規(guī)做法。

基于固相置換原理的桌面式分液器顯著提高了 3D 細胞培養(yǎng)設置過程效率，并實現(xiàn)了工作流程的標準化，以獲得更可靠數(shù)據(jù)。

以固相置換為原理的分液器使活塞直接與注射器內(nèi)的液體接觸，因此沒有空氣柱和液體。這種方法是處理Corning Matrigel ?等粘稠試劑的理想選擇，具有高準確性和高精度。(¹⁷)

SPT Labtech的dragonfly? discovery 等系統(tǒng)實現(xiàn)了低至 200 nL以上的準確分液，從而能夠有效實現(xiàn)實驗體系微縮化。這不僅能夠降低試劑和特殊細胞的成本，而且還能從容應對起始材料（例如患者來源的細胞）稀缺的情況。它的死體積較低，僅為30 uL；這樣，用戶便能夠設置比手動移液或傳統(tǒng)分液方法更多的重復實驗。速度和溫度控制對于ECM制劑（如 Matrigel ? 或 Cultrex）處理至關重要。從速度上來看，非接觸式分液同樣非常適合，因為注射器能夠在Matrigel ?升溫凝固之前快速（不到1分鐘）完成一個96孔板的分液。如果需要多板分液，則輔助的被動冷卻模塊可以使試劑在一定時間內(nèi)保持在低溫狀態(tài)。

自動化使得用戶能夠標準化 3D 細胞培養(yǎng)設置，因此，唯一的檢測變量是靶向介入（藥物、基因組擾動、RNA 敲除）和輸入細胞群的異質(zhì)性。由于需要進行高內(nèi)涵分析，那么能夠在板或芯片的預設位置進行精準分液的分液器便具有極大優(yōu)勢，因為它可以減少高內(nèi)涵分析所需要覆蓋的成像區(qū)域。這既適用于2D細胞培養(yǎng)表型分析，同時對需要z軸多層掃描的3D圖像更為重要。

使用dragonfly? discovery等桌面式分液器可極大簡化 3D 細胞培養(yǎng)的操作設置，但用戶仍然需要考慮培養(yǎng)維護，例如，更換細胞培養(yǎng)基以進行長期培養(yǎng)。 ECM 中的類器官培養(yǎng)物非常脆弱，標準洗板機設置過于苛刻和不精確，無法完全去除培養(yǎng)基。 移液工作站可能是一個替代方案，但是他們依賴于使用一次性移液槍頭，而此項花費甚高。因此，一些研究人員傾向于在類器官內(nèi)使用磁珠，這樣便能夠在吸出或補充培養(yǎng)基時將類器官轉(zhuǎn)移到孔板上的安全位置。

3D 細胞培養(yǎng)應用越來越受青睞，我們預計這種趨勢仍將持續(xù)數(shù)年。 (18) 目前，3D 細胞培養(yǎng)模型的優(yōu)勢與成本、通量和可用性之間仍然需要權衡。鑒于自動化有助于顯著降低3D細胞培養(yǎng)應用的障礙，研究人員可針對具體的問題自行選擇最合適的實驗模型。

我們預計在不久的將來，采用球體和類器官模型應用于藥物研發(fā)領域（包括篩選）以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學應用進入臨床實踐的情況會有所增加。 3D 細胞培養(yǎng)的最大優(yōu)勢之一是表型分析提供的多參數(shù)分析。 研究人員已經(jīng)利用基因組干擾 (CRISPR-Cas 9/RNAi) 來模擬和理解疾病生物學。 我們希望看到 NGS 技術越來越頻繁地與 3D 細胞培養(yǎng)技術結合使用。

隨著科學家們不斷開發(fā)新技術來優(yōu)化 3D 細胞培養(yǎng)工作流程，該領域的研究前景一片光明。

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